雄激素受体PROTAC降解剂的体外血浆稳定性研究
转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)
前列腺癌 (PCa) 是男性最常见的癌症之一。 去势抵抗性前列腺癌（CRPC）也称为激素抵抗性或激素非依赖性前列腺癌，是指经过初次持续雄激素剥夺治疗(ADT)后疾病依然进展的前列腺癌。转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)具有高风险和致命性，且到目前为止还无法治愈。
雄激素受体拮抗剂，例如恩杂鲁胺(Enzalutamide)，阿帕鲁胺 (Apalutamide) 和达洛鲁胺 （Darolutamide），可有效治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。 但用这些雄激素受体拮抗剂治疗的患者最终会发展出耐药性。而在大多数抗雄激素受体拮抗剂具有抗性的肿瘤中，雄激素受体信号仍然具有功能性，并依然促进肿瘤的生长和进展。雄激素受体拮抗剂的主要抗性机制包括雄激素受体基因扩增，突变及表达等。 因此，迫切需要新的治疗策略，来有效地靶向肿瘤中的雄激素受体信号。
蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)
PROTAC是具有三个化学元素的异双功能小分子：两种结合配体，一种特异性于靶蛋白，另一种特异性于E3泛素连接酶，以及连接这两种配体的连接链。PROTAC可通过泛素-蛋白酶体系统降解靶蛋白。与传统抑制剂的竞争性和占位驱动的过程不同，PROTAC在其作用方式上是催化性的，可以在低暴露量下也促进靶蛋白质降解。 PROTAC降解目标致病蛋白并调节相关信号通路，这是传统小分子抑制剂或激活剂无法实现的。 作为一种高效的新技术，PROTAC已经在学术界以及制药和生物技术行业引起了极大的关注。
雄激素受体（AR）PROTAC降解剂
基于PROTAC的雄激素受体降解剂是一种双功能小分子，由与雄激素受体合的雄激素受体配体组成，以及与E3连接酶复合物结合并募集E3连接酶复合物的配体，通过Linker连接在一起。
ARV-110是进入人类临床试验的第一个雄激素受体PROTAC降解剂，具有优秀的临床活性和安全性。 ARV-110是一种首创的、口服有效的选择性雄激素受体降解剂。 ARV-110作用于LNCAP和VCAP细胞系，在低nM浓度下即可抑制细胞生长。同时在进行体内研究时发现，使用ARV-1110和Enzalutamide对携带AR+前列腺癌异种移植模型的小鼠进行口服给药时，ARV-1110比Enzalutamide抑制肿瘤生长更有效。 且临床数据表明，ARV-1110的耐受性良好，有效减少了患者肿瘤组织中的雄激素受体蛋白。 ARV-110的数据表明，雄激素受体PROTAC降解剂有望为AR+ MCRPC治疗的新疗法提供新的疗法。
在这项研究中，研究人员设计合成并评估了一系列雄激素受体PROTAC降解剂，其中 ARD-2585 是最有潜力的一个。
ARD-2585 是一种口服有效的雄激素受体PROTAC降解剂。ARD-2585 在具有 AR 基因扩增的 VCaP 细胞系和携带 AR 突变的 LNCaP 细胞系中 DC50 值达到 ≤0.1 nM 。ARD-2585 有效抑制 VCaP 和 LNCaP 细胞生长，IC50 值分别为 1.5 和 16.2 nM，并在小鼠中具有出色的药代动力学和口服生物利用度 (51%)。ARD-2585 在抑制 VCaP 肿瘤生长方面比 Enzalutamide 更有效，且不会对小鼠造成任何毒性迹象。所以，ARD-2585 是一种有前途的雄激素受体降解剂，可用于治疗晚期前列腺癌。
ARD-2585化学结构
ARD-2585体内药效评价
科研人员接下来测试了 ARD-2585 在 VCaP 异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤活性，对照组为 Enzalutamide。ARD-2585 按 10、20 和 40 mg/kg 三种剂量给药均有效抑制肿瘤生长。在治疗结束时 (第 37 天)，与空白对照组相比，ARD-2585 抑制肿瘤生长分别达54.9%、74.3% 和 65.9%。相比之下，Enzalutamide (40 mg/kg) 抑制肿瘤生长为 45.0%。所以，ARD-2585 (20 和 40 mg/kg）在抑制肿瘤生长方面比 40 mg/kg 的 Enzalutamide 更有效。同时，ARD-2585 和 Enzalutamide 均具有良好的耐受性，且在整个实验期间均未引起动物体重减轻或其他毒性迹象。
ARD-2585在VCAP异种移植瘤模型的药效研究
（Enzalutamide作为阳性对照）
ARD-2585的血浆稳定性研究
研究人员通过美迪西在在五种不同种属 (小鼠、大鼠、犬、猴和人)中测试了ARD-2585的血浆稳定性。 ARD-2585在五种种属中均具有出色的血浆稳定性（T1/2> 120分钟）。 实验在小鼠，大鼠，犬，猴和人离体组织中研究了ARD-2585的体外稳定性。
将待测化合物溶解在DMSO中，终浓度为10 mM，然后在0.1 M缓冲液中稀释至10 μM。 将90 μL在37°C下预热的血浆添加到96孔板中，然后用10μL 10μM待测化合物进行加标，使待测化合物的终浓度为1 μM。将加标血浆样品在37°C下孵育2小时。 通过添加400 μL含有IS的乙腈使反应在0、5、15、30、60和120分钟处终止。淬火后，置于600 rpm转速的摇床上，并在LC/MS分析之前储存于-20°C。 在LC/MS分析之前，样品在室温解冻，并以6000 rpm转速离心20分钟。 将每个孔中的100μL上清液转移到含有100μL水的96孔样品板中进行LC/MS分析。Procaine用作小鼠、犬、猴和人血浆稳定性研究的标准对照，Benfluorex用作大鼠血浆稳定性研究的标准对照。
ARD-2585（Compound 43）是一种非常有效的雄激素受体降解剂。 研究人员评估了六种化合物小鼠的药代动力学。 其中，ARD-2585和Compound 45静脉内给药后具有出色的药物分布体积（VSS=1.8-2.1 L/kg），较长的半衰期（T1/2=5.5-7.5 h），且清除速度缓慢（Cl= 0.2-0.3 L/h/kg）。ARD-2585 (5 mg/kg) 进行口服给药，Cmax达到1140 ng/mL，AUC为8254 h*ng/mL。 ARD-2585(3 mg/kg) 进行口服给药，Cmax达到484 ng/mL，AUC为8637 h*ng/ml。 ARD-2585的口服生物利用度为51％。
研究人员进一步使用ARD-2585 (20 mg/kg)对携带VCAP异种移植肿瘤的小鼠进行单个口服给药，研究药物在组织中的分布。数据表明，与其出色的PK曲线一致，ARD-2585广泛分布在组织中。
总结
PROTAC 为新药研发的漫漫征程打开了一个新的篇章。 PROTAC引起的靶向蛋白质降解已成为药物开发的一种高效治疗策略。 目前，PROTAC已成功地用于降解与各种疾病有关的不同类型的靶蛋白，包括肿瘤，病毒感染，免疫疾病和神经退行性疾病等。
在本研究中，研究人员设计合成了口服有效的雄激素受体PROTAC降解剂ARD-2585。ARD-2585可有效抑制VCAP肿瘤生长。且ARD-2585在肝微粒体和血浆中都非常稳定，具有良好的PK参数。因此，ARD-2585可用于进一步评估AR+前列腺癌，作为一种有潜力的雄激素受体降解剂在治疗和研究前列腺肿瘤方面起着关键作用。
参考文献:
[1] Weiguo Xiang, et al. Discovery of ARD-2585 as an Exceptionally Potent and Orally Active PROTAC Degrader of Androgen Receptor for the Treatment of Advanced Prostate Cancer. J Med Chem. 2021 Sep 23;64(18):13487-13509. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00900.
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[3] Thi-Thao-Linh Nguyen, et al. Development of an LC-MS/MS Method for ARV-110, a PROTAC Molecule, and Applications to Pharmacokinetic Studies. Molecules. 2022 Mar 18;27(6):1977. doi: 10.3390/molecules27061977.
